RNA Interferenz durch T-MIDGE® Vektoren / Aus der Reihe: e-fellows.net stipendiaten-wissen Bd.Band 1877 (PDF)

Bachelorarbeit aus dem Jahr 2010 im Fachbereich Biologie - Genetik / Gentechnologie, Note: 1,3, Technische Universität Berlin (Biotechnologie), Sprache: Deutsch, Abstract: Die RNA Interferenz durch kurze nicht-kodierende RNA Sequenzen (siRNA) erlaubt es der Forschung, neue Therapiemöglichkeiten für die Behandlung von Krankheiten, die ihre Ursache in fehlerhaften Regulationsmechanismen der Genexpression haben, zu entwickeln.
Das patentierte minimalistische Design der MIDGE® Vektoren ermöglicht eine siRNA Expression mit Hilfe von kleinen Expressionskassetten, die innerhalb der Zelle transient und ohne großen Einfluss auf weitere Signalwege eine gezielte Inhibierung der Genexpression bewirken können. Um bestehende Patentansprüche zu umgehen und einfachere, effizientere RNAi Vektoren zur Verfügung stellen zu können, werden modifizierte T-MIDGE® hergestellt und getestet.

Hierfür wurde mit synthetischen Methoden ein nicht-linearer DNA Vektor hergestellt, welcher durch Transfektion in Säugerzellen eingebracht wurde. Die Voraussetzung für eine erfolgreiche Herstellung der Vektoren und Prozessierung innerhalb der Zelle stellt hohe Ansprüche an die Reinheit der genutzten Oligodesoxynukleotide, welche zuerst erfolgreich optimiert und validiert wurden.

Die Untersuchung der Gen-Knockdown-Eigenschaften erfolgte in CHO-K1 Säugerzellen aus Hamsterovarien mit einem dualen Luciferase-Reportergen Assay in Hinsicht auf den maximalen Gen-Knockdown sowie die Effizienz der neu entwickelten T-MIDGE® Vektoren.
Hierbei zeigte sich ein deutlich verminderter Knockdown-Effekt im Vergleich zu linearen MIDGE® Vektoren oder weit verbreiteten Plasmid-basierten Vektoren. Dies führte zur weiteren Entwicklung neuartiger Einzelstrangvektoren, die nach erfolgreicher Synthese ebenfalls im Zellversuch getestet wurden. Der Gen-Knockdown blieb hierbei ebenfalls hinter linearen MIDGE® Vektoren zurück. Die Ursachen für den stark verminderten Knockdown-Effekt konnten in weiteren Versuchen nicht eindeutig auf molekulare Prinzipien zurückgeführt werden.

Um detaillierte Aussagen treffen zu können, müssen die Teilschritte der Versuchsdurchführung besonders in Hinblick auf die Effizienz der Transfektion und im Folgenden auf die Effizienz der Transkription untersucht werden. Dazu wurden erste Ansätze zur quantitativen PCR Analyse, sowie ein in vitro Transkriptionsassay entwickelt, die jedoch nicht mehr durchgeführt werden konnten. Die Ergebnisse zeigen erfolgreich die Herstellung und Funktionalität eines Einzelstrang-basierten DNA Vektors zur siRNA Expression in Säugerzellen.