Bestimmung und Optimierung von Colchicin-Alternativen für die Doppelhaploiden-Technik bei Mais (Zea mays L.) (PDF)

In der Maiszüchtung stellt die Doppelhaploidentechnik eine zeitsparende Alternative gegenüber der herkömmlichen Erzeugung homozygoter Linien dar. Die DH-Technik lässt sich in zwei Schritte unterteilen: 1.) die Induktion von maternalen Haploiden durch Bestäubung mit sogenannten Inducerlinien und 2.) die Aufregulierung der Chromosomen-sätze zur Erzeugung von Doppelhaploiden durch die Behandlung mit einem Mitosegift. Insgesamt können bei jedem Schritt zwischen 1 - 10 % Haploide bzw. Doppelhaploide erzeugt werden. Dies zeigt somit noch ein deutliches Optimierungspotential auf. Zum einen ist der Mechanismus der Haploideninduktion noch nicht vollständig geklärt und die Induktionsraten sind teilweise stark vom jeweiligen Genotyp abhängig. Zum anderen wird zur Aufregulierung der Chromosomensätze immer noch sehr häufig das im Speziellen für Säuger hochtoxische Alkaloid Colchicin eingesetzt. Aufgrund seiner geringen Spezifität für Pflanzenspindeln wird eine relativ hohe Menge an Colchicin benötigt, was die Anwendung teuer und vor allem für den Anwender gefährlich macht.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es die Doppelhaploiden-Technik bei Mais durch die Bestimmung von mindergiftigen und möglichst effizienten Colchicin-Alternativen zu verbessern. Hierfür wurden folgende Arbeitsschritte durchgeführt:

- Beurteilung von möglichen Colchicin-Alternativen durch Behandlung von Wurzelspitzen (chemische Substanzen, physikalische Methoden).
- Optimierung der Inkubationsparameter zur Behandlung von Haploiden mit Colchicin-Alternativen.- Ermittlung neuer Colchicin-Alternativen über Hochdurchsatz-Screening einer Chemikalien-Bibliothek.
- Untersuchung des Mechanismus der Haploideninduktion.

Bei der Behandlung von Wurzelmeristemen konnte gezeigt werden, dass die drei Herbizide APM, Oryzalin und Pronamid als Colchicin-Alternativen eingesetzt werden können. Verglichen mit Colchicin weisen sie alle eine deutlich geringere Toxizität für Säuger auf. Außerdem wäre ihr Einsatz durch die deutlich geringer benötigten Konzentrationen auch kosteneffizienter als eine Colchicinbehandlung. Nach Behandlung Haploider konnten jedoch bisher mit keiner Alternativbehandlung Doppelhaploide erzeugt werden.
Die Behandlungsparameter für Colchicin konnten im Rahmen der vorliegenden Arbeit weiter optimiert werden. So zeigte sich durch die Belüftung der Behandlungslösung ein deutlicher Anstieg der Keimlingsvitalität. Außerdem konnten nach der Behandlung zwei Tage alter Keimlinge die meisten Keimlinge mit verdoppeltem Chromosomensatz erzeugt werden. Aufgrund der vielversprechenden Eigenschaften der Herbizide APM, Oryzalin und Pronamid sollten weitere Experimente durchgeführt werden, sobald größere Mengen an haploidem Saatgut zur Verfügung stehen.
Das Screeningverfahren der LATCA-Bibliothek unter Verwendung einer transgenen Arabidopsis thaliana Linie zeigte sich als äußerst effektiv zur Ermittlung von Mitoseinhibitoren. Nach Durchführung des Screenings von ~3600 chemischen Substanzen in drei Stufen konnten 51 Kandidaten von Colchicin-Alternativen ermittelt werden. Diese Substanzen sollten durch Behandlung von haploiden Maiskeimlingen genauer evaluiert werden. Denkbar wäre auch das Screening weiterer Bibliotheken zur Entdeckung von Mitoseinhibitoren.
Durch ein besseres Verständnis des Mechanismus der Haploideninduktion könnte diese Technik verbessert und somit der Einsatz von Colchicin eingeschränkt werden. Anhand der bisherigen Ergebnisse können jedoch keine Aussagen über den Mechanismus der Haploideninduktion getroffen werden. Das eingesetzte Testsystem sollte daher noch weiter optimiert werden.
Die vorliegende Arbeit konnte zeigen, dass die Effizienz zur Erzeugung doppelhaploider Maispflanzen durch den Einsatz von Colchicin-Alternativen verbessert werden könnte. Außerdem konnten nach einem Screening von ~3600 chemischen Substanzen mittels A. thaliana 51 Chemikalien als potenzielle Mitoseinhibitoren detektiert werden.