Versuchsprotokoll: Messung der Responsivität von TLR9 auf extrazelluläre Stimuli mittels Luziferase-Reportergen-Assay (ePub)

Praktikumsbericht / -arbeit aus dem Jahr 2011 im Fachbereich Biologie - Humanbiologie, Note: 1, Philipps-Universität Marburg, Sprache: Deutsch, Abstract: Die Zellen des Immunsystems besitzen unterschiedliche Strategien zur Reaktion auf
extrazelluläre Stimuli (z.B. Pathogene). Beginnend bei der Bindung des Antigens durch einen
spezifischen Rezeptor wird eine intrazelluläre Signalkaskade in Gang gesetzt, die zumeist in
einer Aktivierung von Trankskriptionsfaktoren (TF) resultiert. Diese TF vermitteln schließlich
im Nukleus die transkriptionelle Aktivierung von Zielgenen. Eine Rezeptorfamilie mit
wichtiger Funktion bei der Immunantwort auf verschiedene Pathogene sind die sog. "tolllike"
Rezeptoren (TLR), deren Stimulation über die Aktivierung von Signaltransduktoren, z.B.
des nukleären TF ¿B (NF-¿B) im Falle des TLR9, die Bildung von proinflammatorischen
Zytokinen befördert.
Das Ziel dieses Versuchs war die Untersuchung der Stärke der Aktivierung von NF-¿B als
Reaktion des TLR9 auf unterschiedliche Antigene, um dadurch Aussagen über die
natürlichen, spezifischen Liganden des Rezeptors treffen zu können.
In dem durchgeführten Versuch wurden TLR9-exprimierende HEK293-Zellen ("human
embryonic kidney cells") verwendet und mit Plasmiden transfiziert, die für das Enzym
Luziferase kodierende Gene enthielten, deren Promotoren eine NF-¿B-spezifische
Erkennungssequenz aufwiesen. Die Auslösung der TLR9-Signalkaskade durch ein passendes
Antigen sollte sich daher in der Bildung von aktivem NF-¿B niederschlagen und in der Folge
die Transkriptionsaktivität des Reporterenzyms Luziferase erhöhen. Durch die Zugabe von
Luziferin, das bei der Umsetzung durch die Luziferase bioluminesziert, war es aufgrund der
Korrelation der Stärke eines TLR9-Stimulus mit dem bei der Reaktion emittierten Licht
möglich, die immunologische Reaktion von TLR9-exprimierenden Zellen auf diverse Antigene
zu untersuchen.
Mit dieser Technik wurden die bakteriellen Antigene Lipopolysaccharid (LPS) und Pam3Cys,
PolyIC, ein Analogon viraler dsRNA, sowie die Oligodesoxynukleotide (ODN) 1668 (mit
normalem CpG-Motiv) und 1720 (mit invertiertem CpG-Motiv) auf ihre Interaktion mit dem
TLR9 getestet.