Funktionelle Charakterisierung von Enzymen des Sekundärstoffwechsels in Lavendel (Lavandula angustifolia) und Erdbeere (Fragaria x ananassa) (PDF)

Pflanzen synthetisieren eine immense Zahl von sekundären Inhaltsstoffen wie Terpene, Alkaloide und phenolische Substanzen. Die Biosynthese dieser Verbindungen wird von entsprechend vielen verschiedenen Enzymen gewährleistet. Drei Enzymgruppen, deren Reaktionen eine große Rolle im Sekundärstoffwechsel spielen, sind in dieser Arbeit betrachtet worden: Glucosyltransferasen, Terpensynthasen und Acyltransferasen.
Kürzlich wurde eine UDP-Glucose:Cinnamat-Glucosyltransferase der Kulturerdbeere (Fragaria x ananassa) (FaGT2) beschrieben, die die Bildung von Zimtsäure- und p-Cumarsäure-Glucoseester während der Fruchtreifung katalysiert. Dieses Enzym, das in der Erdbeerfrucht reife- und stressinduziert exprimiert wird, setzt jedoch auch weitere, strukturell verschiedene Substrate natürlichen und anthropogenen Ursprungs in vitro um. Deren Reaktionskinetiken wurden verglichen, um zusätzliche biologische Funktionen des Enzyms aufzuklären. Das Spektrum der akzeptierten Substrate reichte von Zimtsäure- und Benzoesäurederivaten über heterozyklische und aliphatische Strukturen und resultierte in der Bildung von O- und S-Glucoseestern sowie O-Glucosiden. Die Synthese der glucosidischen Verbindungen wurde in planta bestätigt, nachdem die Substrate in reife Erdbeeren injiziert worden waren. Als gemeinsame chemische und strukturelle Eigenschaften, die für die enzymatische Aktivität erforderlich sind, wurden die einfache Deprotonierung der Glucosylierungsstelle und die Konjugation der dabei gebildeten Anionen mit S-Elektronen identifiziert. Sorbinsäure repräsentiert das Substrat mit der einfachsten Struktur, das mit sehr hoher Effizienz umgesetzt wurde. Als natürliche Substrate wurden neben Zimtsäure auch Anthranilsäure, (E)-2-Hexensäure, Nicotinsäure und 2,5-Dimethyl-4-hydroxy-3[2H]-furanon glucosyliert. Die glucosidischen Produkte dienen möglicherweise als Vorläufersubstanzen von wichtigen Aromastoffen oder als Speicherungsformen. FaGT2 setzte aber höchst effizient auch Xenobiotika um wie das Herbizid 2,4,5-Trichlorphenol oder die zu einem Herbizidmetaboliten analoge 3,5-Dichlor-4-hydroxybenzoesäure. Diese Ergebnisse in Verbindung mit der stressinduzierten Expression von FaGT2 legen nahe, dass das Enzym in die Detoxifizierung von Xenobiotika involviert ist.
In den Früchten der kultivierten Erdbeere (Fragaria x ananassa) trägt der Monoterpenalkohol Linalool, der überwiegend als (S)-Enantiomer vorliegt, zum Aroma bei. Die Biosynthese des (S)-Linalools in Erdbeerfrüchten wurde kürzlich aufgeklärt und wird von der Terpensynthase FaNES1 katalysiert. In den Blättern von Fragaria x ananassa und vor allem in denen der wilden Erdbeere (Fragaria vesca) liegt neben (S)-Linalool ein höherer Anteil (R)-Linalool vor. Durch eine Polymerase-Kettenreaktion-Strategie (PCR-Strategie), die die Homologie von Terpensynthase-genen ausnutzt, wurden aus komplementärer DNA (cDNA) von Blättern der Arten Fragaria vesca und Fragaria x ananassa zwei Teilsequenzen extrahiert, die sehr hohe Identitäten mit FaNES1 aufweisen. Aus Fragaria x ananassa wurde FaLINS in Volllänge kloniert, das codierte Protein in Escherichia coli exprimiert und mit dem Substrat Geranyldiphosphat (GPP) umgesetzt. Mittels multidimensionaler Gaschromatographie-Massenspektrometrie wurde nachgewiesen, dass FaLINS trotz einiger Sequenzunterschiede zu FaNES1 ebenfalls ausschließlich (S)-Linalool bildet. Offenbar handelt es sich bei den beiden Sequenzen um unterschiedliche Allele oder paraloge Gene, die in Blättern und Früchten differenziert exprimiert werden. In Fragaria vesca wurde bereits eine Linaloolsynthase (FvNES) mit unbekannter Stereospezifität nachgewiesen, die ebenfalls homolog zu FaNES1 ist, jedoch ein zusätzliches N-terminales Sequenzelement enthält. Dieses Enzym wurde wie FaLINS heterolog exprimiert und in einem Enzymassay untersucht. Da es ausschließlich (S)-Linalool bildet, kann ausgeschlossen werden, dass der N-terminale Sequenzabschnitt die Stereospezifität der enzymatischen Reaktion beeinflusst.
Das wirtschaftlich bedeutsame etherische Öl des Echten Lavendels (Lavandula angustifolia) enthält eine große Zahl an Mono- und Sesquiterpenen. Ähnlich wie in der Erdbeere wurden durch eine Homologie-basierende Strategie die drei neuen Terpensynthasen LaLIMS, LaLINS und LaBERS kloniert. Die phylogenetische Analyse zeigte, dass deren Sequenzen den Terpensynthasen aus anderen Vertretern der Familie Lamiaceae ähneln. Die Enzyme wurden heterolog in Escherichia coli exprimiert und biochemisch hinsichtlich optimaler Reaktions-bedingungen (pH-Wert, Temperatur und Cofaktorkonzentrationen) und kinetischer Parameter charakterisiert.
LaLIMS bildet die sechs Monoterpene Limonen (39 %), Terpinolen (22 %), Camphen (16 %), D-Pinen (14 %), E-Myrcen (8 %) und D-Phellandren (1 %). Die Analyse mittels Chiralphasen-Gaschromatographie zeigte, dass in großem Überschuss die Enantiomere (1R,5R)-(+)-D-Pinen, (1R,4S)-(+)-Camphen und (R)-(+)-Limonen synthetisiert werden. Die Assays ließen zudem eine unterschiedliche Produkt-zusammensetzung bei Verwendung von Mangan-und Magnesiumkationen erkennen, was den Einfluss dieser Cofaktoren auf die Struktur und Reaktion der Terpensynthasen unterstreicht. Multiproduktsynthasen wie LaLIMS erklären, wie die vielen unterschiedlichen Terpene im etherischen Öl entstehen, ohne dass eine entsprechend große Zahl an Enzymen vorhanden sein muss. LaLINS katalysiert die Transformation von GPP zu ausschließlich (R)-Linalool. Die stark bevorzugte Bildung des (R)-Enantiomers korrespondiert mit der Konfiguration der Hauptinhaltsstoffe des Lavendelöls, (R)-Linalool und (R)-Linalylacetat. Daher dürfte das Enzym von entscheidender Bedeutung für das Aromaprofil von Lavandula angustifolia sein. Das dritte Enzym, LaBERS, ist eine Sesquiterpensynthase und bildet aus Farnesyldiphosphat (FPP) überwiegend trans-D-Bergamoten (74 %). Es handelt sich um die erste beschriebene trans-D-Bergamotensynthase. Mit geringer Effizienz katalysiert sie auch die Bildung von Monoterpenen aus GPP. Sie gehört phylo-genetisch zur Klasse TPS-b der Terpensynthasefamilie, in der nahezu nur Monoterpensynthasen eingeordnet sind. Sie stellt damit ein weiteres Beispiel einer Sesquiterpensynthase dar, die vermutlich aus einer Monoterpensynthase hervorging. Obwohl die drei Terpensynthasen nur für einen Teil der Terpene des etherischen Öls von Lavandula angustifolia verantwortlich sind, stellt die Kenntnis ihrer Gensequenzen eine Grundlage dar, mit der die gezielte genetische Modifizierung von Lavendelpflanzen und die Beeinflussung ihres Aromaprofils ermöglicht wird.
Im etherischen Öl von Lavandula angustifolia tragen auch die Ester von Terpenalkoholen und kurzkettigen Alkoholen, vor allem Linalylacetat, wesentlich zum Aroma bei. Da deren Biosynthese von Acyltransferasen der BAHD-Superfamilie katalysiert wird, wurden basierend auf dem gemeinsamen Aminosäuremotiv DFGWG die beiden Sequenzen LaAT1 und LaAT2 in Volllänge kloniert. Phylogenetisch ist LaAT1 verwandt mit der Acyltransferasen-Untergruppe V, die als Donorsubstrate Coenzym A-Ester von Hydroxyzimtsäuren und Benzoesäure benötigen und die Säurereste auf die Hydroxy- oder Aminofunktionen von Chinasäure und Shikimisäure sowie Anthranilsäure und deren Derivaten übertragen. LaAT2 enthält ebenfalls alle charakteristischen Sequenzelemente der BAHD-Acyltransferasen, weist aber insgesamt wenig Ähnlichkeit zu den bisher beschriebenen auf und könnte Mitglied einer neuen Untergruppe sein. LaAT1 und LaAT2 wurden heterolog in Escherichia coli und Saccharomyces cerevisiae exprimiert und in einem Substratscreening mit unterschiedlichen Coenzym A-Estern und Alkoholen umgesetzt. Lediglich LaAT1 war in Enzymassays aktiv und katalysierte als erster Vertreter der BAHD-Superfamilie die Bildung sowohl von Amid- als auch Esterbindungen, die in Caffeoyl- und Cumaroylshikimat, Caffeoyl-und Cumaroyltyramin sowie Cumaroylanthranilat resultierte. Bisher wurde die Synthese der Tyraminderivate in Pflanzen ausschließlich der Familie der Tyramin-N-hydroxycinnamoyltransferasen zugeschrieben, die sich deutlich von den BAHD-Acyltransferasen unterscheiden. LaAT1 ist damit zwar nicht in die Aromabiosynthese involviert, könnte aber andere wichtige Funktionen im Sekundärmetabolismus übernehmen.